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目的

細菌內毒素測試（BET，Bacterial Endotoxins Testing）的創新技術問世后，證明平臺間測試的等效性就變得至關重要?！癝ievers*Eclipse比例確認測試”旨在確認使用96孔微孔板時的樣品與鱟試劑的1:1比例始終對使用Eclipse微孔板也同樣有效。只要保持1:1比例，就能使樣品和鱟試劑（LAL，Limulus Amoebocyte Lysate，鱟變形細胞溶解物）之間的生物化學反應保持不變。即使在使用Sievers Eclipse平臺時減少光學孔的總容積，每個孔中的1:1比例也能保持不變，用戶可以確信樣品和標準品的內毒素測量值是準確有效的。

背景和重要性

使用96孔微孔板的動態顯色法細菌內毒素檢測技術，要求在每個孔中加注標準品或樣品與鱟試劑的混合液，然后觀察液體的顏色變化。測試成功的關鍵在于精確控制樣品和鱟試劑的用量。USP<85>規定，對于某些測試參數（例如體積比、反應起效時間、pH值等），應遵循鱟試劑生產商提供的使用說明（IFU，Instructions for Use）。

使用說明通常以下兩種方式之一來表明如何達到正確的樣品和鱟試劑的體積比：

（1）直接表明樣品和鱟試劑的比例應為1:1；

（2）指示用戶加入100µL的空白鱟試劑水、內毒素標準品、產品樣品、陽性產品對照，然后向所有使用的孔中加入100µL的鱟試劑。

有的使用說明指示用戶準備1:1樣品與鱟試劑混合液時，建議使用100µL（而非典型的200µL）作為孔的總容積，并指出100µL有助于達到最佳的測試靈敏度。該使用說明表明，1:1的比例關系（而非孔的總容積）才是測試成功的關鍵。只要每個孔中的樣品和鱟試劑的比例是1:1，反應就能準確進行，產生的結果就是等效的。

如果比例不是1:1，那么樣品與鱟試劑的用量就不對，就會對反應動力學過程和整體測試結果產生顯著影響。除了孔的總容積之外，還需考慮反應速度。如果反應較快，那么起始反應時間就較短，內毒素濃度就較高。如果反應較慢，則情況相反——起始反應時間較長，內毒素濃度較低。

錯誤的比例還會影響鱟試劑在與樣品混合時的自然緩沖能力。如果達不到1:1的精確比例，則反應混合液的pH值就不在建議的6-8范圍之內，就會影響測試的整體反應動力學過程。

1:1比例確認測試

1:1比例確認測試旨在證明在Sievers Eclipse微孔板的104個孔中都達到了鱟試劑和樣品的1:1精確比例。進行測試時，用戶需要一個新的Sievers Eclipse微孔板和Sievers Eclipse 1:1比例確認套件（部件號是STD 85000-01），該套件包括一個水瓶和一個染色劑瓶。開始分析之前，Eclipse軟件會指導用戶在對應的位置和鱟試劑LAL端口，完成水和染色劑的準備和注射。然后，Eclipse微孔板按照正常分析時的步驟運行。1:1比例確認測試不依賴于動力學酶促反應，因此測試所需的總時間較短。

1:1比例確認測試的報告內容

分析完畢后，Eclipse軟件的“1:1比例結果（1:1 Ratio Results）”選項卡中會顯示報告。報告內容除了包括在運行測試之前輸入的常規信息（例如分析儀序列號、Eclipse微孔板信息、1:1比例確認樣品信息），還包括104個光學孔的各自的平均光密度。在報告的“結果”部分下面，分別顯示微孔板“染色劑”部分和“水”部分的總體平均光密度。染色劑分別同微孔板另一半上的染色劑和水混合，產生上述兩個平均值。下面的方程1用于計算總體平均光密度值，該值顯示溶液的混合是否成功。這可以用來表示在正常分析時樣品和LAL是如何混合的。

在染色劑與水混合的孔中，染色劑被稀釋到原來濃度的一半，理想的比例為0.5（即水平均值）。將這兩個平均值相除，得出的理想比例為2，表示到達光學孔的染色劑和水的量相同。對于本次測試來說，1.90至2.10之間的比例都是有效的，不影響整體反應動力學曲線和內毒素回收率。

結論

Sievers Eclipse微孔板是精密設計的微流控液體處理設備。此款微孔板利用計量分配腔，以恒定的通道幾何形狀和運動方式，將精確等量的樣品和鱟試劑同時送到光學孔中。正是Eclipse微孔板的精密的液體控制能力，確保了每次測試的所有104個光學孔中都達到樣品與鱟試劑的1:1關鍵性比例。

鱟試劑生產商提供的使用說明可能會直接表明1:1比例，也可能會指導用戶混合一定量的樣品和鱟試劑，但液體總體積未必一定是200µL。如果光路徑較長，或者為了進行精確移液，生產商會建議設置較大容積，以提高測試精度。對于標準的96孔微孔板來說，建議設置的孔的總容積在75-200µL范圍內?！盀榱诉M行有效測量，建議設置的微孔板的最小孔容積通常大于最大孔容積的1/3?！?所以，每次測試的每個孔中的樣品與鱟試劑的比例達到1:1，非常重要，而沒有必要使用整個孔的容積。

在Sievers Eclipse平臺上進行1:1比例確認測試的結果證明，即使孔的總容積顯著減小，每次測試的每個光學孔中都能達到至關重要的1:1比例。始終保持1:1的精確比例，用戶就能確認在轉換平臺時，生物化學過程是等效的。建議每年由Sievers分析儀認證的現場服務工程師或代表來完成此項確認測試任務。

參考文獻1.Pusterla,Tobias,PhD.“Which is the best microplate for my assay?”BMG Labtech,2018 May 30.

• SieversEclipse細菌內毒素檢測儀

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